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唾液活檢在腫瘤領域的研究現狀

2018-10-19 14:28:14點擊:

唾液是澄清透明、呈微酸性的體液,正常人每天可分泌1.0~1.5 L。唾液腺具有高通透性,被豐富的毛細血管所包繞,這使得血液中的分子與鄰近的唾液腺細胞中的分子能進行自由交換。因此,唾液中不僅含有與血液相同的酶、激素、抗體以及生長因子等蛋白質,還包括mRNA、miRNA和DNA等遺傳信息,且這些物質在唾液和血液中的表達水平密切相關。血液是傳統的液體活檢材料,基于血液循環DNA的基因突變檢測和基于血液循環腫瘤細胞的分子生物學分析在腫瘤診斷、臨床治療及預后評價方面具有重要作用。血液中的蛋白質及核酸進入唾液,使其含有與機體生理病理狀態相關的生物學信息,因此唾液同樣是有前景的液體活檢材料。

與血液相比,唾液活檢有獨特的優勢,取材方便、無創且可避免血源性的感染。以往認為由于解剖位置的特殊性,唾液活檢只對頭頸部腫瘤(如口腔癌)具有診斷價值,而越來越多的實驗證實它同樣可應用于機體遠端的腫瘤(如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌)[6],由此看出唾液活檢不受腫瘤空間位置的限制。而且,腫瘤發生發展過程中蛋白質、核酸的變化均能由唾液活檢進行實時監測,不受腫瘤進展時間的限制。本研究以唾液中發現的腫瘤標志物為線索,從檢測技術、臨床應用兩個層面概括唾液活檢在腫瘤領域的研究現狀,并對其發展的前景與挑戰進行展望。


一、唾液活檢檢測技術研究

唾液活檢的主要目的是探尋蛋白質含量的變化特征以及核酸分子遺傳信息的改變,以了解機體在正常與腫瘤狀態下的差異。近年來隨著質譜分析技術(mass spectrometric analysis,MS)以及二代測序技術(next generation qequencing,NGS)的快速發展,對唾液蛋白質組學以及基因變異的研究已獲得重大突破。

(一)蛋白質檢測技術

唾液蛋白質成分具有復雜性,以往大都用二維聚丙烯凝膠電泳(PAGE)的方法進行分離,隨著質譜分析儀的發展,蛋白質得以更精確地分類鑒定,美國加州大學洛杉磯分校(UCLA)已建立起唾液蛋白質組數據庫,包含的蛋白質達千余種,且綜合信息不斷地更新,形成了一個可在全世界范圍內進行交流的平臺,對口腔生物學、唾液診斷學等領域的研究有巨大推動作用[7]。

(二)RNA檢測技術

唾液RNA的檢測方法主要是芯片技術,其不足之處在于50%的唾液RNA呈片段狀,不攜帶Poly-A尾巴,易被降解;此外在RNA擴增試驗中多采用隨機啟動的方法,導致了RNA分子信息的丟失。Wong. D T. 團隊研發了一種用于唾液mRNA擴增的試劑盒-Express Art TRinucleotide mRNA Amplification Kit,其特點是用錨定寡核苷酸與三核苷酸引物的混合物替代傳統的寡核苷酸引物,能對不攜帶Poly-A尾巴的RNA片段進行有效的逆轉錄;且三核苷酸引物使擴增循環中的逆轉錄都遵循統一嚴格的啟動,避免了隨機擴增帶來的RNA信息的丟失。應用此方法鑒定的唾液外顯子核心轉錄組包括1 370個探針組合,代表了85%的唾液樣本中851個特定基因。

(三)基因變異檢測技術

1.基因突變檢測技術:

目前唾液基因突變檢測的方法包括普通PCR和微滴式數字PCR(ddPCR)相關的方法。唾液中突變的模板濃度較低,普通PCR容易出現假陰性,ddPCR通過對樣品的隨機分布進行分析,使生物標志物的研究實現了精確地"數字化" 。以表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)突變為例,在T790M突變的非小細胞肺癌人群中,AZD9291的治療往往受困于獲得性C797S突變引起的繼發性耐藥。應用ddPCR技術對C797S進行分析,可檢測到0.05%~0.1%的突變頻率。

此外,值得一提的是處于研發狀態的電場誘導釋放定量技術(Electric Field-Induced Release and Measurement,EFIRM),該該技術在檢測p.E746-A750缺失時,可檢測低至0.1%的突變頻率;檢測L858R時,1%的突變可被檢測到,在非小細胞肺癌組檢測的唾液和血漿中EGFR突變具有強相關性(p.E746-A750缺失:R=0.98, P<0.000 1;L858R點突變:R=0.99, P<0.000 1)。

2.DNA甲基化檢測技術:

腫瘤組織中的DNA甲基化改變,通過靈敏的方法同樣可在唾液中檢測到。Illumina公司的Golden Gate DNA甲基化平臺(DNA Methylation Cancer Panel I)目前廣泛地應用于甲基化檢測,在樣本中的DNA被重亞硫酸鹽轉化后,探針可以準確地探測到甲基化位點[11]。近來興起的全基因組DNA甲基化測序將重亞硫酸鹽方法和Illumina HiSeq高通量測序平臺相結合,可達到單堿基分辨率,快速分析每個胞嘧啶的甲基化狀態,從而構建精細的全基因組DNA甲基化圖譜。


二、唾液中潛在的生物標志物及臨床應用研究

(一)蛋白質類標志物

人類唾液中含有多種蛋白質,雖然含量僅為血液中的30%[6],但唾液仍然被認為是富含蛋白質標志物的液體活檢材料。

據報道,唾液中的白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-α以及轉鐵蛋白[12,13,14,15]等可作為檢測口腔癌的標志物,實驗顯示:白細胞介素-8在區分口腔鱗狀細胞癌患者和健康人時曲線下面積(Area Under The Curve,AUC)值最高,為0.749。近來發現,原發性口腔鱗狀細胞癌患者的唾液Cyfra21-1水平[(85.95 ± 78.00)μg/L]高于健康人[(42.27 ± 40.84)μg/L,P=0.009];且術后復發患者為[(130.95± 66.38)μg/L],高于無復發人群[(74.84 ±63.45)μg/L,P=0.023。以上表明,唾液中蛋白質濃度變化一定程度上反映了口腔癌發生發展的進程,這對于口腔癌的篩查、診斷以及復發等具有重要參考價值。

在乳腺癌研究中,Bigler等的結果顯示唾液中c-erbB-2蛋白濃度在治療后顯著降低(t=4.245,P<0.000 1),且隨著治療的進行持續降低。相似地,乳腺癌患者唾液CA15-3水平[(5.26 ± 4.12)U/mg]顯著高于健康組[(2.27± 1.54) U/mg]和乳房良性疾病組[(2.22±1.95) U/mg,P<0.05]。

(二)核酸類標志物

1.RNA標志物:

在健康人和患者的唾液中能檢測到3 000余種mRNA和300種miRNA[20,21],有學者評估了唾液轉錄組學標志物對胰腺癌患者的診斷效能,發現12種mRNA水平在胰腺癌患者和健康人之間的差異有統計學意義(P<0.05),聯合應用其中的4種:KRAS、MBD3L2、ACRV1和DPM1,能夠對這兩個群體進行區分,AUC值為0.971,敏感性和特異性為90%和95%[22]。另有研究發現,唾液中miR-9、miR-134和miR-191在區分頭頸部鱗狀細胞癌患者和健康人時具有很好的效能,AUC值分別為0.85(P<0.000 1), 0.74(P<0.001) 和0.98(P<0.000 1)。

2.DNA標志物:

基因突變是癌癥患者DNA分子中常見的遺傳變異,現已成為癌癥診斷、靶向治療以及療效監測的重要指標。近年來,隨著游離DNA(cfDNA)在液體活檢領域成為熱點,唾液作為一種新興的檢測cfDNA突變的材料受到了廣泛關注。在40例晚期非小細胞肺癌患者的唾液樣本中,探索19號外顯子p.E746-A750缺失和21號外顯子L858R點突變的診斷效能,AUC值分別為0.94和0.96[10],這表明唾液cfDNA的EGFR突變檢測可作為非小細胞肺癌的診斷指標應用于臨床。

在表觀遺傳學領域,DNA甲基化是最早發現的修飾途徑之一。Viet和Schmidt[11]研究了口腔鱗癌患者唾液DNA的甲基化位點,構造了甲基化標志物池,其敏感度為62%~77%,特異度達83%~100%。另外,有研究發現隨年齡的增長DNA甲基化模式發生改變,EDARADD、TOM1L1和NPTX2三個基因的甲基化與年齡的增長呈線性相關[24],這說明基于唾液的甲基化檢測篩查對年齡相關性疾病可能具有一定可行性。

綜上,新技術的發展極大地促進了唾液活檢的發展,為實現其在腫瘤領域的應用奠定了堅實基礎,我們根據相關技術與臨床應用將唾液活檢的研究現狀進行匯總整理,見表1。


三、唾液研究的前景和挑戰

過去十年時間里唾液的優點不斷被實驗所證實,促進了唾液診斷學無價值論向前景論轉變。目前初步結果顯示,唾液不但可以用來診斷口腔癌等頭頸部區域的局部腫瘤,對于肺癌、胰腺癌和乳腺癌等遠處腫瘤同樣具有診斷價值,然而仍需進一步的科學驗證為唾液的診斷能力提供支持?;诖罅垦芯空咚龅呐?,唾液診斷學研究呈現出空前的盛況,在未來醫學中唾液檢測將會成為體格檢查的項目,以協助臨床醫生對疾病進行篩查和實時監測。

然而將唾液檢測應用到臨床還要克服眾多限制條件,比如,相比理論我們實際可獲得的唾液體積有限,以及唾液中尚有大量的標志物處于未知階段。未來將唾液腫瘤標志物作為檢測項目,良好的質量控制是保障檢測結果快速、準確、及時的基礎,質量控制的核心是對分析前、分析中和分析后各因素實施嚴格的系統性規范,主要包括分析前標本采集、運輸和儲存(溫度要求)等條件的一致性,分析中標準化、分析后參考區間、醫學決定水平和解釋性備注等的標準化,最終目標是使在不同時間、地點及分析系統上得到的檢測結果具有分析質量和臨床要求上的等同性。當前的首要挑戰是探索唾液中的標志物并通過具體實驗確定其特異性和敏感性、實現收集方法和處理方法的規范化,進而解決質控樣本標準化及商品化的問題。一旦攻克了這些難題,并在大型臨床試驗中加以驗證,唾液診斷學才能最終獲得FDA的批準而廣泛應用于臨床。


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