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鏈霉親和素在生物診斷中應用簡介

2018-1-5 20:53:24點擊:
一、鏈霉親和素性質
鏈霉親和素streptavidin,SA)是由鏈霉菌streptomyces avidinii分泌的一種蛋白質,分子量為54kD。鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成,其氨基酸組成中,甘氨酸和丙氨酸的含量較大,而且結合生物素的活性基團也是肽鏈中的色氨酸殘基;鏈霉親和素是一種稍偏酸性(pH6.0)的蛋白質,并且不帶任何糖基。

鏈霉親和素分子中每條肽鏈都能結合一個生物素,因此與親和素一樣,一個鏈霉親和素分子也能結合4個生物素分子,二者親和常數(K)亦為1015L/mol。在蛋白水解作用下,鏈霉親和素可在N端10~12和C端19-21間斷裂,形成的核心鏈霉親和素仍然保持完整的結合生物素的能力。鏈霉親和素的活性單位也是以結合1μg生物素所需的量來表示,1mg鏈霉親和素的最高活性可達18U。

 
二、親和素(AV)和鏈霉親和素SA)的比較
相同點
1、 生物素結合能力:AV:13~15U,SA:14~18U
2、 活性中心依賴于色氨酸-懶氨酸:親和素在氨基酸序列的70-70和110-111兩個位點有色氨酸-懶氨酸,鏈霉親和素在氨基酸序列的79-80和120-121兩個位點含有色氨酸-懶氨酸。
 
不同點:
1、 分子量:AV=66KD, SA=54KD
2、 等電點:AV=10.5, SA=6.0, AV帶正電較多,非特異性結合較強。
3、 位阻效應:SA的生物素結合位點較AV深,位阻效應較強,長臂生物素更適合。
4、 生物素的結合:AV隨機結合,SA協同結合。
5、 氨基酸序列:AV含二硫鍵和10%糖,SA含甘氨酸丙氨酸較多,無糖和二硫鍵。
 
三、鏈霉親和素在ELISA中的應用

聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑:

①固相的抗原或抗體,②標記的抗原或抗體,③作用的底物。

根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。


生物素-鏈霉親和素系統在ELISA中的應用有多種形式:
1、用于間接包被:可以在固相上先預包被鏈霉親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過鏈霉親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗原間接包被。這種包被法主要有以下優點:
① 增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。
② 陰性對照、空白對照本底低,檢測敏感性高。
③ 鏈霉親和素替代抗體包被微孔,避免了抗體包被微孔時容易發生失活(或不易保存)。
④ 通過生物素將抗體結合于鏈霉親和素包被的標板上,可克服傳統物理吸附方法造成的抗原抗體結合能力大量喪失的不足。

⑤ 生物素標記捕獲抗體、標指示抗體和樣品中的抗原三者在均相中形成復合物后,再通過生物素結合于鏈霉親和素包被的標板上,由于鏈霉親和素和生物素之間親和力極強,并且具有高度的特異性和穩定性,因而可提高檢測靈敏度。

實例:CTnT檢測實驗中,雙抗體夾心ELISA法最低檢測值為7.25μg/L,使用鏈霉親和素包被法最低檢測值達到1.0μg/L,較雙抗體夾心ELISA法靈敏度提高7倍。

 

2、   用于終反應放大:在常規ELISA中的標抗體也可用生物素化的抗體替代,然后連接親和素-結合物,以放大反應信號。

由于SA的等電點低,表面帶的正電荷少,因此它和聚苯乙烯板載體的靜電吸附力弱,SA的陰性對照顯色明顯比AV低,這樣在ELISA上應用SA可進一步提高方法的靈敏度。鏈霉親和素對生物素化的抗體是一個主動的吸附過程,生物素化的抗體吸附在鏈霉親和素表面,抗體排列整齊,分布均勻,抗體容易保持功能,而被動吸附抗體排列極不規則容易導致大量抗體失去功能,所以將生物素-鏈霉親和素免疫反應系統引入競爭法中,可以大大提高聯免疫的靈敏度和特異性。

實例1: 地高辛的生物素-鏈霉親和素免疫法測定實驗中,傳統方法被動吸附只有約5% 的抗體具有功能 ,生物素-鏈霉親和素體系中60% 的抗體具有功能。
實例2:淋球菌抗原測定方法實驗中,生物素-鏈霉親和素法檢測靈敏度為0.625 μg/L,相當于3.5×104/ml淋球菌,而同時進行常規ELISA測定時,其靈敏度為1.25 μg/L。
 
四、鏈霉親和素相關商品
1、 標記化鏈霉親和素
或熒光素等修飾鏈霉親和素,應用于ELISA放大檢測信號,提高檢測靈敏度。
產品實例:
① 綠色熒光素(FITC)標記Streptavidin蛋白
② 辣根過氧化物標記鏈霉親和素

2、 鏈霉親和素標板
鏈霉親和素直接或間接預包被在標板上,穩定性高,易于保存,使用時只要加入生物素化的抗體或者抗原即可。

3、 鏈霉親和素磁珠
鏈霉親和素磁珠由超順磁微粒與高純度鏈霉親和素共價結合而成。磁珠可用于捕獲生物素標記的底物,包括生物素標記的抗原、抗體和核酸。由于生物素-鏈霉親和素的相互作用很強,其結合常值(Ka)為 1015 M-1,并且鏈霉親和素的非特異性結合率很低,使得被捕獲的底物可滿足后續實驗要求,包括 mRNA 的分離和一抗、二抗的獲得。

產品實例:
PuriMag G-Streptavidin鏈霉親和素磁珠
產品描述:
親和素包被的PuriMag G磁珠為分離生物素抗體、核酸或其他生物素配體和靶分子的最佳選擇。這種鏈親和素-生物素的高親和力 ( Kd值10-15 )在分子上有著廣闊的應用。磁珠是單層而不是多層的鏈親和素重組體。這對自由生物素或生物素配體和靶分子而言,在空間排列有著絕大多數的生物素結合位點。沒有過量的物理吸附鏈親和素確保了只有微量的鏈親和素會遺漏。批次間變化小,結果重復性好。
優點和特性:
? 直接快速捕獲任何生物素靶分子
? 靈活的固相操作和優化的液相反應動力學
? 磁性操作易于適應自動化平臺
? 批次重復性高,結果可靠一致

應用:
PuriMag G-Streptavidin已達到了前所未有的廣泛應用。主要應用在制備單鏈DNA模板,分離RNA和DNA結合蛋白,固定長鏈DNA片段,純化測序產品,特效捕獲核酸。
濃度:10mg/ml
儲存條件:2-8
結合能力:
磁珠的結合能力由DNA片段長度決定。 1mg磁珠結合4,000 pmoles自由生物素,400 pmoles生物素標記的核苷酸(單鏈) ,10 - 20μg生物素標記抗體和10 pmoles的2 - 4 kb雙鏈DNA片段。
英文名稱:PuriMag G-Streptavidin

中文名稱:PuriMag鏈霉親和素磁珠

更多請參考:http://www.jsxwttc.com/Product/8271042221.html

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