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磷酸化蛋白質和 磷酸化肽段的富集方法概述

2019-2-11 18:53:34點擊:

      蛋白質翻譯后修飾 (post-translational modification,PTM)可以改變蛋白質結構和活性、 介導細胞信號轉導,細胞對外界環境刺激的響應往往通過PTM實現。PTM類型眾多,包括磷酸化、 乙?;?、泛素化和糖基化等.在眾多類型的 PTM 中,磷酸化是最受關注的。磷酸化修飾是一 種可逆的蛋白質修飾,通過磷酸化修飾的變化,可以調控蛋白質活性、影響信號傳遞過程。磷酸化修飾是細胞健康和疾病的核心調控機制之一,依靠眾 多種類激酶和磷酸酶,細胞可以迅速地增加或減少蛋白質的磷酸化修飾,實現復雜而精確地調控。真核生物中約有 1/3 的蛋白質具有磷酸化修飾,這也體現了磷酸化修飾的普遍性和重要性。磷酸化蛋白質組學在過去20年間發展迅速,多種生命過程都用磷酸化蛋白質組進行了描繪.如對細胞周期的磷酸化解析、不同小鼠組織磷酸化差異譜圖、胰島素分泌機制等。此外,磷酸化蛋白質組研究應用于多種臨床問題研究,推動了人們對疾病發病機制的認知,并提供了一系列臨床疾病治療靶點和治療方案。比如通過外泌體中蛋 白質磷酸化篩選乳腺癌生物標志物、通過小鼠腦不同區域G蛋白偶聯受體 (G protein-coupled receptor,GPCR)的激活研究藥效和藥靶等。 基于質譜的自下而上(down-top)的蛋白質組研究方法是常見的解析磷酸化蛋白質組方法,下面重點討論下磷酸化肽段富集。
      磷酸化修飾肽段的豐度相對整體細胞而言是很低的,直接地全覆蓋質譜檢測,非磷酸化的肽段會形成很高的背景信號,影響磷酸化肽段的檢測。因此磷酸化肽段的檢測,首先需要進行富集;此外,對樣品進行預分離、分成多個組分,也是降低復雜程度、提高檢測深度的常用方法。

1. 富集方法分類 
      磷酸化肽段的富集方法,是整個實驗流程中最多變的部分。磷酸基團與金屬親和的方案是最流行的方案,其中應用最廣泛的兩種是固相金屬離子親和色譜(immobilized metal affinity chromatograph, IMAC)和金屬氧化物親和色譜(metal oxide affinity chromatography,MOAC)。
      IMAC 建立時間約有20 年,利用過渡態金屬陽離子,如 Fe3+、Ga3+、 Zr4+ 等,作為親和試劑,與陰離子結合.Ti4+ 離子是該類試劑中新興的應用。這些金屬陽離子通過螯合作用,固定在具有磁性的磁珠或硅顆粒上, 從而在去除非磷酸化肽段的過程中能夠保留磷酸化的肽段。
      MOAC 方法建立約 10 年,利用氧化金屬可以和磷酸根基團中的氧結合的特性進行磷酸化肽段的富集。氧化鈦(TiOx)是最常用的 MOAC 試劑, 此外 Fe3O4 也比較常見。
      IMAC 和 MOAC 方法都可以對磷酸化肽段或者蛋白質進行富集,二者都容易受到酸性肽段影響,比如多羧基集團的肽段會發生非特異性結合。IMAC 所得樣品容易含有金屬離子或者金屬 鹽的污染,需要進行脫鹽處理.并且 IMAC 方法對多磷酸化修飾的肽段具有偏好性,容易丟失單磷酸化修飾的肽段。和 IMAC 相比,MOAC 方法靈敏度更高、選擇性更好。由于金屬氧化物具有很好的穩定性,因此 MOAC 方法對 pH 值等環境因素的改變具有更好的耐受。 IMAC 和 MOAC 方法都是針對絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點(pSer、pThr、pTyr) 進行富集的方法。Matheron 等2014 年比較了兩種方法對HeLa 細胞中的磷酸化富集,發現只有 40%磷酸化肽段是重合的.不過,在肽段長度、位點和模序(motif)等方面,二者并沒有明顯的不同。最重要的是,生物學的差異,而不是方法上的差異,對結果起到最主要的影響. 
      免疫共沉淀方法,是專門用于富集酪氨酸磷酸化的主流方法,結合了基于金屬的富集方法和基于 抗體的富集方法中的優勢,該方法能夠高特異 性的對酪氨酸磷酸化位點進行富集.目前,針對酪氨酸的特異性抗體正在不斷涌現. 

2. 富集方法的發展 
       肽段的檢測深度依賴于酶解效率、傳統的胰酶 (trypsin)酶解,能夠在賴氨酸和精氨酸的 C 末端進 行剪切。但通過對不同酶的比較,發現兩種不同酶的酶切后,檢測到的磷酸化位點只有 1/3 的重合,這說明不同酶酶切后檢測到的位點不同。利用多種酶共同作用,可以提高酶切效率,提升檢測 的覆蓋深度。比如利用 LysC 和胰蛋白酶(trypsin) 共同酶解,可以提高 40%的磷酸化檢測位點。 預分離也是提高鑒定深度的方法。反向液相預分離(reversed phase liquid chromatograph,RPLC)是 常用的分組分方法,此外還有強陽離子交換(strong cation exchange,SCX)和強陰離子交換(strong anion exchange,SAX)方法。Ruprecht 等在比較不同 富集方法時發現,通過親水強陰離子交換預分離, 48 h 的檢測可以獲得 15000 條磷酸化肽段,要比 4 h 檢測 5500 條磷酸化肽段的鑒定深度有所提 高。此外,覆蓋度的提升,使得數據間的相關性明顯提升。強離子交換方法可以和 TiOx 富集方法結合,但是還沒有和抗體富集方法結合的例子。 Batth 等在 2014 年比較了 SCX 和 RPLC 分組分方法,發現 RPLC 方法能夠鑒定到更多的磷酸化肽段,RPLC 方法鑒定到 17 566 條磷酸化肽段, SCX 方法鑒定到 6215 條肽段。并且 RPLC 方法實 驗流程更加簡便,不用額外替換溶液環境。也有一些親和方法,用于富集磷酸化的蛋白質 而非肽段.因為蛋白質常以復合物形式行使功能, 因此該方法能夠鑒定細胞中復合物的情況。如 Hoehenwarter 等利用 Al(OH)3 富集促細胞分裂劑激活的蛋白激酶.目前,該領域還在持續發展中。


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